Laktik Asit Bakterileri, Gıda alanında, rahat ve hızlı bir üretime uygun yöntemler ile besinsel değeri fazla, güvenilir ve bekleme ömrü uzun olan ürünlerin eldesi esas teşkil etmektedir. Fakat tüketicilerin doğal veya bilinen yöntemler ile imal edilen, kimyasal katkı maddesi bulunmayan, sağlık üstünde olumlu etkileri bulunan gıdaları tercih etmesi sebebi ile imal sürecinde doğal olmayan koruyucular kullanılmamaktadır.
Günümüzde ise gıda güvenliğinin uluslararası önemini artmasıyla birlikte, sisteme uygun olan doğal gıda koruyucularının kullanılması ve sektörde yer almasına dair çalışmalar hız kazanmıştır. Konuya bu durumdan bakıldığında laktik asit bakterilerinin organik asit, diasetil, asetoin, hidrojen peroksit, reuterin, antifungal peptitler ve bakteriyosinler gibi çok farklı antimikrobiyal bileşikleri oluşturabilme kapasitesine sahip oldukları ve özellikle bu sebeple son 15 senedir doğal gıda koruyucusu olarak kullanımlarının yaygınlaştığı görülmektedir.
LAB’nin önemli çeşitleri arasında Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ve Weisella yer almaktadır. LAB; aerotolerant anaerob organizmalar biçiminde isimlendirilmektedir.
Karbonhidrat metabolizmaları göz önüne bulundurulduğunda homofermantatif ve heterofermantatif olarak iki alt grupta oluşan LAB taksonomisi, uzun senelerden buyana bakterilerin fenotipik özellikleri göz önüne alınarak gerçekleştirilmektedir. Bu değerlendirmeye göre LAB; (i) Thermobacterium, (ii) Streptobacterium ve (iii) Betabacterium biçiminde üç alt grupta bulunmaktadır. Fakat günümüzde oluşan moleküler biyoloji teknikleri sayesinde, fenotip temelli sınıflandırmanın uygun bulunmadığı ileri sürülmektedir.
LAB’nin önemli metabolitlerinden olan ve biyokoruyucular olarak adlandırılan bakteriyosinler, Gram (+) bakterilerce ribozomal olarak sentezlenen, kısmen dar spektrumda bakterisidal aktivite oluşturan, ısıya dayanıklı, küçük yapılı aktif proteinlerdir. Bakteriyosinler, 4 ana grupta bulunmaktadır, bunlar lantibiyotikler (grup I), değiştirilmemiş peptitler (grup II), büyük proteinler (grup III) ve dairesel peptitler (grup IV) biçiminde ismlendirilmektedir.
Gıda biyo korumasında bulunan LAB’nin bir çoğunun, lineer (grup Ia), değiştirilmemiş peptitler (grup II) ve dairesel peptitlere (grup IV) ait olduğu bildirilmektedir. Geçmiş senelerde yapılan çalışmalarda bakteriyosinlerin gıda koruyucusu biçiminde oldukça faydalı özellikler bulundurabildikleri net bir biçimde ortaya konmuştur.
Gıdalara koyucu olarak bakteriyosin takviyesi ile; (i) gıdaların ömrünü uzatılabilmekte, (ii) saklama koşulları uygun olmadığı sıcaklıklarda uygun koruma oluşturmakta, (iii) gıda kökenli patojenlerin besin zinciri ile dağılım riski düşmekte, (iv) gıdalarda bozulmalara neden olan mikroorganizmalar sebebi ile yaşanan ekonomik kayıplar en aza düşürülmekte, (v) kimyasal koruyucuların kullanımları düşürülmekte, (vi) koruma oluşturmak için daha az prosesin uygulanması nedeni ile ürünün organoleptik özellikleri ve besinsel değeri de daha iyi bir şekilde muhafaza edilmektedir.
Bununla beraber bakteriyosinlerin kullanımını kısıtlayan faktörler de yer almaktadır. Bu faktörler, dar aktivite spektrumu, kendiliğinden bakteriyojenikliğin kaybı, iii) proteolitik enzimler sebebi ile inaktivasyonu, iv) gıda ortamlarına kültürün zayıf adaptasyonu, v) alçak üretim düzeyi ve vi) bakteriyosine dayanıklı bakterilerin meydana gelmesi ile özetlenebilmektedir.
Günümüzde LAB’nin pek çok üyesi bakteriyosin oluşturmakta, antibakteriyel etki Lactobacillus acidophilus tarafından imal edilen acidophilin ve lactocidin, Lactobacillus plantarum tarafından imal edilen lactolin veya Lactococcus lactis tarafından imal edilen nisin gibi antibiyotik ve antibiyotik benzeri maddeler üstünden açıklanabilmektedir.
İmal edilen bakteriyosinler aracılığıyla bakteriyosinin cinsine bağlı bir şekilde özellikle Staphylococcus aureus, Listeria spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens gibi gıda kökenli patojen bakteriler inhibe edebilmektedirler. Bununla beraber bakteriyosinlerin bazı Gram (-) bakteriler üstünde de etkin bulunduğu tespit edilmiştir.
Laktobasillerce imal edilen, lactocin 27, lactacin B, helveticin J, plantaricin B ve plantaricin A gibi bakteriyosin ve bakteriyosin gibi maddelerle ilgili araştırmanın literatürlerde bulunduğu görülmektedir.
Bu grupta yer alan bakterilerin genel tanımı; Gram pozitif, spor oluşturmayan, katalaz negatif, sitokroma sahip olmayan, aerobik olmayan ama aerotolerant, asidi tolere edebilen, kuvvetli fermentatif olup şeker fermentasyonu sırasında başlıca son ürün olarak laktik asit üreten kok veya çubuk şeklinde bakterilerdir.
Laktik asit bakterileri genellikle besin içeriği bakımından zengin olan ortamlarda, örneğin süt, et ve sebzelerde bulunmaktadırlar.
Bu bakterilere örnek olarak, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus ve Lactococcus cinsi bakteriler verilebilir. Bu bakterilerin
ortak özelliği laktozdan laktik asit fermentasyonu sonucu, laktik asit
oluşturmalarıdır.
Analizi yapılacak gıda numunesinden
yeterli miktarda örnek, aseptik koşullarda alınır ve laboratuvara getirilir.
Laboratuvara gelen örnek, 1:9 oranında
(10gr örnek:90ml dilusyon sıvısı vb) dilusyon sıvısı ile seyreltilir.
Seyreltimi tamamlanmış örnek Stomacher
cihazı veya manuel olarak homojenize edilir. Bu seyreltim 1/10’luk dilusyondur ve beklenen mikroorganizma sayısına göre bu seyreltimden direkt ekim yapılabilir veya yine 1:9 oranında ileri seyreltimleri yapılarak 1/100’lük, 1/1000’lik vb dilusyonlar hazırlanabilir ve ekim bu dilusyonlar ile gerçekleştirilebilir.
Dilusyon sıvısı olarak BPW (Buffered Peptone Water), %85’lik NaCl veya MRD (Maximum Recovery Diluent) kullanılabilir.
analize hazırlık işlemlerinin gerçekleştiği ortam sıcaklığı 30°C’yi geçmemelidir.
Seyreltme işlemi yapıldıktan sonra tercihen 15 dakika içinde ekim işlemi bitirilmiş olmalıdır. Bu süre uzarsa, hızlı çoğalan bakteriler sayılarını artırabilir. Homojenizasyon aşamasından itibaren ekime kadar geçen süre en çok 30 dakikadır.
(Analiz hazırlığına ilişkin verilen genel kurallar başta ISO 7218, ISO 6887 ve FDA olmak üzere uluslararası kontrol kuruluşlarından derlenmiştir. Bunlardan, "ISO 7218 TS 7894 sayılı Gıda ve Hayvan Yemlerinin Mikrobiyolojisi- Mikrobiyolojik Muayeneler İçin Genel
Kurallar" ve "ISO 6887 TS 6235 sayılı Gıda ve Hayvan Yemleri
Mikrobiyolojisi- Deney Numunelerinin Başlangıç Süspansiyonunun ve Ondalık Seyreltilerinin Hazırlanması İçin Genel Kurallar" adlı yayınlar, Türk Standartları Enstitüsü'nden sağlanabilir.)Hazırlanmış seyreltimden 0,1ml örnek
alınır ve MRS Agar üzerine yayma plak yöntemi ile ekim yapılır.
Ekimi yapılmış petriler, anaerobik ortam
sağlayıcı içerisine yerleştirildikten sonra inkübatöre kaldırılır.
Laktik asit bakterileri için inkübasyon süresi, 30°C’de 2-4 gündür.
Süre sonunda oluşan tipik görünümlü bakteri kolonilerinden örnekler seçilerek ileri tanımlama testlerine devam edilir.
Testlerde bu koloniler birkaç kez daha kültüre edilmelidir; çünkü tanımlama testlerinde kullanılacak kolonilerin saflaştırılmış olması gerekmektedir. Dentifikasyon testlerinde, 18-24 saatlik saf bakteri kültürleri kullanılır.
Saflaştırılmış kolonilerin laktik asit bakterilerine ait olup olmadığını anlamak amacıyla, ilk olarak gram boyama ve katalaz testleri yapılır.
Gram boyama: Laktik asit bakterileri Gram(+) ve sporsuz bakterilerdir. Kok veya çubuk şeklinde olabilirler.
Katalaz Testi: Saflaştırılmış koloni parçası lam üzerine konur. Üzerine H2O2 damlatıldığında köpürme görülüyorsa katalaz (+), köpürme yoksa katalaz (-) olarak değerlendirilir.
Laktik asit bakterileri katalaz negatiftir.
Hareket Testi: Tüplerde dik olarak hazırlanmış, yumuşak agarlı
(medium) besiyeri kullanılır.
Bu bakterilere örnek olarak, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus,
Streptococcus ve Lactococcus cinsi bakteriler verilebilir. Bu bakterilerin
ortak özelliği laktozdan laktik asit fermentasyonu sonucu, laktik asit
oluşturmalarıdır.
Analizi yapılacak gıda numunesinden
yeterli miktarda örnek, aseptik koşullarda alınır ve laboratuvara getirilir.
Laboratuvara gelen örnek, 1:9 oranında
(10gr örnek:90ml dilusyon sıvısı vb) dilusyon sıvısı ile seyreltilir.
Seyreltimi tamamlanmış örnek Stomacher
cihazı veya manuel olarak homojenize edilir. Bu seyreltim 1/10’luk dilusyondur ve beklenen mikroorganizma sayısına göre bu seyreltimden direkt ekim yapılabilir veya yine 1:9 oranında ileri seyreltimleri yapılarak 1/100’lük, 1/1000’lik vb dilusyonlar hazırlanabilir ve ekim bu dilusyonlar ile gerçekleştirilebilir.
Dilusyon sıvısı olarak BPW (Buffered Peptone Water), %85’lik NaCl veya MRD (Maximum Recovery Diluent) kullanılabilir.
analize hazırlık işlemlerinin gerçekleştiği ortam sıcaklığı 30°C’yi geçmemelidir.
Seyreltme işlemi yapıldıktan sonra tercihen 15 dakika içinde ekim işlemi bitirilmiş olmalıdır. Bu süre uzarsa, hızlı çoğalan bakteriler sayılarını artırabilir. Homojenizasyon aşamasından itibaren ekime kadar geçen süre en çok 30 dakikadır.
(Analiz hazırlığına ilişkin verilen genel kurallar başta ISO 7218, ISO 6887 ve FDA olmak üzere uluslararası kontrol kuruluşlarından derlenmiştir. Bunlardan, "ISO 7218 TS 7894 sayılı Gıda ve Hayvan Yemlerinin Mikrobiyolojisi- Mikrobiyolojik Muayeneler İçin Genel
Kurallar" ve "ISO 6887 TS 6235 sayılı Gıda ve Hayvan Yemleri
Mikrobiyolojisi- Deney Numunelerinin Başlangıç Süspansiyonunun ve Ondalık Seyreltilerinin Hazırlanması İçin Genel Kurallar" adlı yayınlar, Türk Standartları Enstitüsü'nden sağlanabilir.)Hazırlanmış seyreltimden 0,1ml örnek
alınır ve MRS Agar üzerine yayma plak yöntemi ile ekim yapılır.
Ekimi yapılmış petriler, anaerobik ortam
sağlayıcı içerisine yerleştirildikten sonra inkübatöre kaldırılır.
Laktik asit bakterileri için inkübasyon süresi, 30°C’de 2-4 gündür.
Süre sonunda oluşan tipik görünümlü bakteri kolonilerinden örnekler seçilerek ileri tanımlama testlerine devam edilir.
Testlerde bu koloniler birkaç kez daha kültüre edilmelidir; çünkü tanımlama testlerinde kullanılacak kolonilerin saflaştırılmış olması gerekmektedir. Dentifikasyon testlerinde, 18-24 saatlik saf bakteri kültürleri kullanılır.
Saflaştırılmış kolonilerin laktik asit bakterilerine ait olup olmadığını anlamak amacıyla, ilk olarak gram boyama ve katalaz testleri yapılır.
Gram boyama: Laktik asit bakterileri Gram(+) ve sporsuz bakterilerdir. Kok veya çubuk şeklinde olabilirler.
Katalaz Testi: Saflaştırılmış koloni parçası lam üzerine konur. Üzerine H2O2 damlatıldığında köpürme görülüyorsa katalaz (+), köpürme yoksa katalaz (-) olarak değerlendirilir.
Laktik asit bakterileri katalaz negatiftir.
Hareket Testi: Tüplerde dik olarak hazırlanmış, yumuşak agarlı
(medium) besiyeri kullanılır.
Saf bakteri kültüründen alınan örnek, iğne özeyle batırma kültür şeklinde
ekilir ve 24 saat inkübe edilir. İnkübasyonu takiben, inokülasyon hattının yanlarına doğru yayılmış bulanıklık şeklinde bir üremenin görülmesi bakterinin hareketli, yalnızca inokülasyon hattı boyunca üreme gözlenmesi bakterinin hareketsiz bir bakteri olduğu sonucunu verir.
Laktik asit bakterileri hareketsizdir.
Bunlardan başka;
Glikozdan CO2 Üretimi
Arjinin
Hidroliz Testi
Nitratın İndirgenmesi
Voges Proskauer Testi
ekilir ve 24 saat inkübe edilir. İnkübasyonu takiben, inokülasyon hattının yanlarına doğru yayılmış bulanıklık şeklinde bir üremenin görülmesi bakterinin hareketli, yalnızca inokülasyon hattı boyunca üreme gözlenmesi bakterinin hareketsiz bir bakteri olduğu sonucunu verir.
Laktik asit bakterileri hareketsizdir.
Bunlardan başka;
Glikozdan CO2 Üretimi
Arjinin
Hidroliz Testi
Nitratın İndirgenmesi
Voges Proskauer Testi
Metil Red Testi
Farklı Sıcaklıklarda, pH’da ve tuz konsantrsyonlarında Gelişme Testleri gibi testler de uygulanabilir.
Farklı Sıcaklıklarda, pH’da ve tuz konsantrsyonlarında Gelişme Testleri gibi testler de uygulanabilir.
İleri tanımlama ve tür tespiti için ise, serolojik testler ve karbon bileşiklerini özümseme testleri ile yapılabilir.
Mikrobiyolojik analizlerinizde kullanmak için firmamız tarafından üretilen Hazır Besiyerlerini kullanabilirsiniz.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder